Ni NTA Beads 6FF(镍填料)

(N30210-1L)Ni NTA Beads 6FF(镍填料)

货号：N30210

存储条件：4-30℃

1、纯化流程 1.1 Buffer 的准备

Buffer 可使用下列推荐Buffer，也可根据自己的使用习惯配置不同的缓冲液体系，基本原理就是低咪唑上样，高咪唑洗脱，或者高pH上样，低pH洗脱。Buffer 在使用前最好用0.22μm 或者0.45μm滤膜过滤除菌。因为Ni NTABeads FF可以用于可溶蛋白和包涵体蛋白的纯化，两种方法所需Buffer 不同，具体配置方法见下表：

(N30210-1L)Ni NTA Beads 6FF(镍填料)可溶性组an酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方:

portant;"> 名称

portant;"> 体积

portant;"> 配方

portant;"> Lysis Buffer

portant;"> 1L

portant;"> 8 M Urea （480.50 g urea）

portant;"> 100 mM NaH2PO4 （15.60 g NaH2PO4·2H2O）

portant;"> 100 mM Tris·HCl （15.76 g Tris·HCl）

portant;"> 使用盐酸溶液调节 pH 至 8.0，

portant;"> 使用 0.22 或者 0.45 μm 滤膜过滤除菌。

portant;"> Wash Buffer

portant;"> 1L

portant;"> 8 M Urea （480.50 g urea ）

portant;"> 100 mM NaH2PO4 （15.60 g NaH2PO4·2H2O）

portant;"> 100 mM Tris·HCl （15.76 g Tris·HCl）

portant;"> 使用盐酸溶液调节 pH 至 6.3，

portant;"> 使用 0.22 或者 0.45 μm 滤膜过滤除菌。

portant;"> Elution Buffer

portant;"> 1L

portant;"> 8 M Urea（480.50 g urea）

portant;"> 100 mM NaH2PO4（15.60 g NaH2PO4·2H2O）

portant;"> 100 mM Tris·Cl（15.76 g Tris·Cl）

portant;"> 使用盐酸溶液调节 pH 至 4.5，

portant;"> 使用 0.22 或者 0.45 μm 滤膜过滤除菌。

包涵体组an酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方：

portant;"> 名称

portant;"> 体积

portant;"> 配方

portant;"> Lysis Buffer

portant;"> 1L

portant;"> 8 M Urea （480.50 g urea）

portant;"> 100 mM NaH2PO4 （15.60 g NaH2PO4·2H2O）

portant;"> 100 mM Tris·HCl （15.76 g Tris·HCl）

portant;"> 使用盐酸溶液调节 pH 至 8.0，

portant;"> 使用 0.22 或者 0.45 μm 滤膜过滤除菌。

portant;"> Wash Buffer

portant;"> 1L

portant;"> 8 M Urea （480.50 g urea ）

portant;"> 100 mM NaH2PO4 （15.60 g NaH2PO4·2H2O）

portant;"> 100 mM Tris·HCl （15.76 g Tris·HCl）

portant;"> 使用盐酸溶液调节 pH 至 6.3，

portant;"> 使用 0.22 或者 0.45 μm 滤膜过滤除菌。

portant;"> Elution Buffer

portant;"> 1L

portant;"> 8 M Urea（480.50 g urea）

portant;"> 100 mM NaH2PO4（15.60 g NaH2PO4·2H2O）

portant;"> 100 mM Tris·Cl（15.76 g Tris·Cl）

portant;"> 使用盐酸溶液调节 pH 至 4.5，

portant;"> 使用 0.22 或者 0.45 μm 滤膜过滤除菌。

1.2样品准备 1.2.1细菌或酵母表达的蛋白

1、挑取单菌落到LB 培养基中，根据载体使用说明加入相应浓度的诱导剂诱导相应的时间。

2、表达结束后，将培养液转移到离心杯中，7,000rpm，离心15min 收集菌体，然后加入1/10 体积的 Lysis Buffer 和 PMSF，PMSF在破碎前加入，最终浓度为1mM。加入溶jun酶（工作浓度为0.2-0.4mg/ml，如果表达的宿主细胞内含pLysS 或pLysE，可以不加溶jun酶），（同时也可加入其他蛋白酶抑制剂，但不能影响目的蛋白与树脂的结合）。

3、将菌体沉淀悬浮起来，（如果菌液浓度高，也可考虑加入10μg/ml RNase A 和5μg/ml DNase I），混匀，放置于冰上，然后冰上超声破碎细胞，至菌液基本保持澄清。

4、将澄清的破碎液转移至离心管中，10,000rpm 下，4 度离心 20-30 分钟。取上清，置于冰上备用或-20度保存。

1.2.2酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达可溶性蛋白

1、将细胞培养液转移至离心杯，5000rpm 下，离心10min，收集菌体得上清，如上清中不含EDTA、组an酸和还原剂等物质，即可直接加入柱子使用；如含有EDTA、组an酸和还原剂等物质，需用1×PBS 4℃下透析才能加入柱子。

2、对于大量体积的上清，需加入硫酸氨沉淀浓缩后，蛋白还需用1XPBS 4℃透析后才能加入柱子。

1.2.3包涵体蛋白纯化(变性条件)

1、将培养液转移到离心杯中，7,000rpm，离心15min 收集菌体，去掉上清。

2、按照菌体：Lysis buffer=1:10(W/V)将菌体悬浮起来，混匀，冰浴超声破碎。

3、将破碎液转移至离心管中，10,000rpm下，4 度离心20-30 分钟。去掉上清，步骤2）和 3）可以重复一次。

4、按照菌体:Lysis buffer(含8M 尿素)=1:10(W/V)将包涵体悬浮起来。

5、变性条件下进行His 标签蛋白纯化，具体缓冲液配方见表4。

更多详情：
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https://www.chem17.com/st534943/product_37801315.html